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芍药花香以及代谢产物实验可鉴别品种

2020-06-02 21:22分类:芍药花 阅读:

文献速览
该研究利用电子鼻和傅立叶变换红外光谱结合多元分析方法,对14个芍药切花品种的花香及代谢产物进行分析,以区分不同品种。芍药花香气的主成分分析(PCA)和判别函数分析(DFA)结果并不完全一致,但聚类结果支持相同的3组品种,同时韩国品种“Taebaek”与“Jubilee”同属一个类群,区别于其他的品种。芍药代谢物的主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)结果表明,14个的芍药品种被分为两大类,同时韩国品种“Taebaek”明显区别于其他品种。研究结果表明,14种芍药切花品种可以根据花香和代谢成分进行鉴别,韩国“Taebaek”的代谢特征具有明显的特点。研究结果可作为芍药新品种选育及促进芍药在美容业推广应用的基础资料。
 
引言
芍药属自古以来凭借其诱人的香味、美丽硕大的花朵和药用价值而被广泛使用。如今芍药作为观赏植物或传统药用植物,广泛种植于欧洲、新西兰、亚洲和北美。在朝鲜、中国和日本,芍药的根被认为是一种药用植物已经有1200多年的历史了。同时由于香水和化妆品行业对天然成分的需求增加,芍药不仅被用作装饰品,而且还被用作工业原料。然而到目前为止,对芍药的生物化学研究主要集中在根上,对芍药的花器官的香味和代谢化合物的鉴别研究相对较少。为了提高产业利用率,有必要对不同品种进行基于代谢特征的性状鉴定和鉴别。
研究的主要目的是为化妆品原料工业提供芍药切花的花香和代谢特征的基本分析,并分析韩国栽培品种“Taebaek”与进口商品芍药切花的关系,为芍药育种提供初步数据。
 
实验材料
一共14个切花芍药品种用于实验 (表1,图1) ,种植于韩国镇川(36°54' 23.7"N,127°28'23.4"E)的 World Flower公司的露天苗圃。
表1. 用于实验的14个切花芍药品种以及形态特征


图1. 用于实验的14个切花芍药品种的花部形态特征
实验方法
电子鼻测试
实验采用Alpha MOS FOX-2000 电子鼻 (法国Alpha MOS公司,法国图卢兹) 分析花香成分。这种电子鼻配备了6个金属氧化物传感器 ,每个传感器都可以检测不同的挥发性化合物并反映特定化合物的浓度。称量每个品种的新鲜花瓣1mg进行电子鼻分析。为了获得最大的传感器响应,针对芍药切花样品优化了电子鼻操作的分析条件,如表2所示。在该系统中,干燥空气载气流恒定设置为150 ml / min,然后将小瓶在40°C下孵育2分钟,并以500 rpm的速度搅拌 (开启5s;关闭2s) 。在这些条件下,花卉挥发物会迁移到顶部空间,并通过自动进样器传输到传感器。采用统计程序Alpha Soft控制仪器和处理数据,使用多变量统计技术 (包括PCA和DFA) 对E型鼻中的数据进行解释。此外,执行了层次聚类分析 (HCA) ,以统计方式分析每个样本的PCA和DFA得分数据中包含的全面关系。
 
FT-IR光谱分析
分别冷冻干燥14个品种的花瓣样品,磨成粉末,并在分析前储存在-70°C下。实验时将200 ul提取缓冲液 (20%甲醇) 添加到20 mg 芍药花瓣粉中,剧烈混合,并在50°C下间断涡旋孵育20分钟。然后将混合物以13,000 rpm离心10分钟,然后将上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中。重复离心直到细胞碎片被完全清除。在FT-IR光谱分析之前,芍药花瓣中的粗提取物暂时保存在-20°C下。
研究从配备了氘化三甘氨酸硫酸盐 (DTGS) 检测器的FT-IR光谱仪 (Tensor 27,Bruker Optics GmbH 公司,德国) 获得光谱。将5ul全细胞提取物加载到384孔硅板上37℃预热。,样品干燥后,将硅板放入微孔板读取器单元HTS-XT中。所有的FT-IR光谱均使用OPUS软件获取。每个光谱在4,000-400 cm-1的范围内扫描,分辨率为4 cm-1。为了提高信噪比,共添加了128个干涉图并与分析结果取平均值,通过减去用于沉积样品的平板光谱 (背景) 来获得红外光谱。对于多变量分析,原始的FT-IR光谱通过校正基线,光谱强度归一化和使用OPUS程序进行平滑处理以及使用Python进行预处理。在数据预处理之后,对光谱数据进行多元分析。
 
对于多变量分析,对FT-IR光谱数据的1,800-800 cm-1区域 (指纹区域) 进行了PCA、PLS-DA和HCA处理。微分后生成的FT-IR光谱数据被导入R程序。PCA根据非线性迭代偏最小二乘 (NIPALS) 算法 (Wold,1966) 进行。根据有监督的模式识别方法,最大程度地分离样品,还使用R程序对不同芍药品种的花中代谢变异的更多离散簇进行了PLS-DA分析。通过分析PCA载荷判断14个芍药品种中代谢变化的重要FT-IR变量。此外,使用R程序进行HCA树状图统计分析每个样品的PCA和PLS-DA得分数据中包含的全面关系。
 
表2. 电子鼻操作的分析条件
实验结果和讨论
基于电子鼻的14个切花芍药品种辨别
图2.  基于电子鼻的不同芍药切花品种的花香成分分析。(A) PCA;(B) DFA;(C)  雷达图;(D) 强度图。
 
通过对电子鼻传感器数据的多元统计分析,对14个切花芍药品种的花香进行了研究 (图2) 。PCA方法使用前两个主要成分 (PC1和PC2) 在二维图中显示了芍药品种电子鼻数据的PCA评分图,分别占总变异的97.2%和2.5% (总计99.7%)  (图2 A) ,属于同一品种的样品都独立成群,表明芍药的花香以与品种相关的方式得以区分,尤其是 “Honey gold”,“Allan rogers”,“Nick shaylor”,“Sarah bernhardt” 和 “Florence nichols” 的气味模式分别与其他品种明显分开。
据观察,大多数电子鼻传感器对所有品种都有反应 (图2C) 。特别是在3个传感器 (包括PA/2,T30/1和T70/2传感器) 中观察到了最重要的信号,这些传感器可以反映有机溶剂,食品风味和挥发性化合物的浓度。P10/1和P4/1的传感器信号也都很高,这些传感器检测非极性挥发物和氟化物或氯化物。结果表明,有机溶剂、食品风味和挥发性化合物以及非极性挥发物和氟或氯是品种间的重要变异因子。
DFA分数图显示在由前两个判别函数 (DF1和DF2) 定义的二维图中,分别占总变化的71.4%和26.1% (总计97.6%)  (图2 B) 。与PCA结果相似,来自同一品种的所有样品被归为一组。但是在DFA得分图中,某些品种之间的差异很小。DFA分数图显示,大多数品种位于DF1分数最大值附近,而“Allan rogers”位于DF1中心,“Honey gold”位于DF1分数最小值附近。尽管大多数品种在DF1区分不明显,但根据DF2可以将这些品种明显地区分。
为了比较不同品种的花朵的气味强度,使用Alpha Soft 提取花朵样品的三个重复样的质心与空白对照之间的欧式距离进行了分析。距离分析表明,根据感官评估,所有品种的相对气味强度都不同 (图2D) 。在 “Allan rogers”品种中观察到最高强度,其次是“Nick shaylor”品种和 “Old faithful”品种。“Blush queen”和“Paul M. wild”的强度较低。'Allan rogers' 品种可以作为浓香新品种育种的合适母本。在所有表现出强烈花香的品种中,“Old faithful”显示出更高的花径,花枝高度和花枝直径 (表1) 。根据PCA和DFA得分图,“Taebaek”品种的花香强度类似于“Jubilee”。考虑到这些结果,“Old faithful”被认为具有极高的观赏和开发价值,对于开发医药和化妆品工业产品非常有利。
 
图3. 基于电子鼻数据的PCA的HCA树状图
 
基于电子鼻数据的PCA的HCA树状图显示,芍药的14个品种分为两个主要类别 (图3 A) 。第一个主要类别由“Nick shaylor” 和“Allan rogers”组成,第二个主要类别由其他 (12个品种) 组成,其下又包括2个子类别。来自电子鼻数据的DFA的HCA树状图 (图3B) 显示 “Honey gold” 和 “Allan rogers” 分别独立成为一组,剩余的12个品种又可以分为2个子类别。总的来说,PCA和DFA结果的HCA树状图均展示了具有相同品种的3个组。第一组包括“Paul M. wild”, “Blush Queen”, “Peter brand”和 “Bowl of cream”。第二组由“Sarah bernhardt”,“Elsa sass”,“Old faithful”和“Florence nichols” 组成。第三组是“Taebaek”和“Jubilee”。与其他品种相比,同一组的品种具有相似的挥发性化合物。
PCA和DFA的总体结果表明,14个芍药花卉样品可以根据它们的花香特征进行聚类区分,所以通过花香挥发性物质对品种进行鉴定是可能的。而实验结果中,中国芍药品种群和杂种芍药品种群之间的花香区分模式不清晰,暗示品种间的代谢差异要大于品种群间。
基于FT-IR光谱的14个切花芍药品种辨别
图4. FT-IR光谱的多元分析。(A) 不同品种的FT-IR代表性光谱。箭头表示品种间存在显著差异的FT-IR光谱区域。(B) 不同品种的FT-IR光谱设计主成分分析评分图。(C) 不同品种的FT-IR光谱的PC负荷值。箭头表示确定PC1和PC2评分的重要光谱区域。(D) 不同品种FT-IR数据的PLS-DA评分图。
 
进行了FT-IR光谱分析和多变量分析,以鉴定出不同的芍药切花品种。芍药品种的FT-IR定量光谱如图4A所示。在14种芍药品种中,在氨基酸和蛋白质的酰胺I和II (1,750-1,500 cm-1) 、磷脂/ DNA / RNA (1,500-1,200 cm-1) 和碳水化合物 (1,150-950 cm-1) 中观察到最显著的光谱变化。这些来自花朵的FT-IR光谱变化表明,芍药品种之间在定性和定量代谢方面存在差异。使用前两个主要成分 (图4B) 在二维图中显示了来自14个芍药品种的FT-IR数据的PCA分数图,分别占总方差的 49.7%和20.5% (总计70.2%) 变异。PCA分数图显示,属于同一品种的大多数切花样品被分成一组,特别是“Old faithful”,“Paul M. wild”和“Taebaek” 与其他品种区分明显。表明与其他品种相比,这些品种在代谢产物成分和水平上具有显着差异。
同时 “Bowl of cream” 、“Honey gold” 和 “Sarah bernhardt” 之间,“Peter brand” 和 “Elsa sass” 之间,均存在一定的重叠,表明这些品种在代谢物水平上具有较高的相似性。
利用主成分分析(PCA)载荷值可以识别出PC1和PC2评分中差异最大的光谱变量。图4C显示决定 PC1和PC2的重要FT-IR光谱变量主要分布在1,700-1,600 cm-1、1,500-1,400 cm-1、1,200-1,150 cm-1和1,050-950 cm-1区域中。
多肽和蛋白质重复单元产生九个特征性IR吸收带 (酰胺A,B和I-VII) ,其中酰胺I和II是蛋白质骨架的两个最突出的振动带,酰胺I (C = O) 谱带的光谱区域 (1,700-1,600 m-1) 对蛋白质的二级结构成分敏感。1,500 -1,300cm-1的光谱区域对应于CH3的C-H键和来自核酸和磷脂的磷酸二酯基团的P=O键。1,200 - 900 m-1光谱区域对应于碳水化合物相关的振动带(C-O-C拉伸、C-OH拉伸、COH变形、COC变形、吡喃糖和呋喃糖环振动)。这些结果表明,14个品种的代谢差异主要与碳水化合物、核酸和磷脂 (磷酸二酯) 以及蛋白质 (酰胺I区) 有关。
PLS-DA的判别结果也与PCA结果具有相似的聚类模式(图4D)。同一品种的芍药样品被紧密地分组成簇。虽然在PLS-DA中仍存在部分品种的重叠现象,但与PCA的结果相似,PLS-DA可将“Old faithful”、“Paul M. wild”和“Taebaek”明确区分为不同的品种。
图5. FT-IR光谱数据的PCA和PLS-DA的HCA树状图
FT-IR光谱数据的PCA和PLS-DA的HCA树状图显示,这14个芍药品种分为两个主要的组 (图5A和5B) 。第一个主要组由多数品种 (11个品种) 组成,包括2个亚组。第一组包含9个品种,除“Florence nichols”外,分为2个分支。第一个分支由 “Sarah bernhardt”, “Jubilee”,“Bowl of cream”和“Honey gold”组成,第二个分支由 “Allan rogers”,“Snow mountain”,“Nick shaylor” 和 “Blush Queen”组成。第二组由 “Paul M. wild”和“Old faithful”组成。第二大类包括“Taebaek”、“Elsa sass”和“Peter brand”。与花香电子鼻分析结果相似,PCA和PLS-DA都无法显示品种群之间的区分模式,但能够明确区分不同品种。此外,尽管在花卉香气分析的PCA和DFA中,”Taebaek”与”Jubilee”重叠,但两者在FT-IR光谱分析中可以被精确区分。同时结果表明与其他品种相比,“Taebaek”具有鲜明的代谢特征。
结论
总之,该研究表明,电子鼻和FT-IR光谱结合多元分析能够辨别不同芍药切花品种中代谢产物的差异。此外,该研究建议将酰胺I和磷脂区域的FT-IR光谱数据以及T30/1、PA/2和T70/2传感器的花香数据用作花香挥发物和代谢指标,以进行描述以及区分不同芍药品种。
同时,通过电子鼻和FT-IR光谱结合多变量分析,可以从香味和代谢化合物的角度确定进口芍药和韩国“Taebaek”的差异,有关植物资源多样性和保护的信息对于育种人员开发新品种和改进特殊表型的现有品种具有重要意义。因此,该研究结果还可应用于芍药新品种的选育和工业原料的开发。

标签:芍药花

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